crioprotector

Refredar la suspensió cel·lular fins a 0 °C i afegir el crioprotector.

Afegir el crioprotector a temperatura ambient i refredar a raó d'1°C/min fns a la temperatura de -7 °C.

La disminució del punt eutèctic induïda peI crioprotector comporta que la concentració de sals donada a una temperature determinada sigui menor, o expressat d'una altra manera, que una concentració donada s'assoleixi a una menor temperatura, de manera que hi hagi un menor gradient osmòtic (vegeu la fig. 6).

A banda d'aquest primer efecte, la presència de crioprotectors podria, a la vegada, afavorir la formació d'un sòlid vitri en lloc de cristal·litzat, ja que a temperatures prou baixes, en arribar a una concentració crítica de crioprotector, la viscositat del medi de congelació es tan elevada que s'impedeix la cristal·lització i la formació de gel inntracel·Iular.

D'entre les moltes molècules que s'han investigat com a presumptes agents crioprotectors, avui en dia n'hi ha tres d'àmpliament acceptades com a tals.

L'ús de metanol com a crioprotector ha provocat un cert recel en la comunitat científica perquè es tracta d'un compost altament tòxic, fins a l'extrem que, per als humans, ingestions de I'ordre de només 30 ml provoquen la mort de l'individu.

Quan es tracta de crioprotectors lents, com que llur addició brusca fàcilment comporta danys per estrès osmòtic, hom prefereix fer llur introducció d'una manera esglaonada, a través de solucions que incorporin concentracions cada vegada més altes de crioprotector.

A mesura que surt aigua, es perd el gradient, en part a causa de l'augment de la concentració intracel·lular de soluts i en part per l'entrada de crioprotector dins de les cèl·lules.

Per al cas concret del PROH, alguns autors ja han demostrat que 1,5 M de PROH és la concentració òptima dins I'estret marge que separa la concentració mínima amb efecte crioprotector de la concentració màxima (3 M de PROH) abans que no es presentin efectes tòxics col·laterals (2).

La sacarosa és un disacàrid de glucosa i fructosa impermeable a la membrana plasmàtica, que actualment s'inclou en la majoria dels protocols de congelació per tal de forçar el gradient osmòtic i aconseguir així velocitats més ràpides d'entrada de crioprotector durant la congelació (de manera que es facilita el fet d'aconseguir un equilibri abans de la formació de gel intracel·lular), i també velocitats més ràpides de sortida durant la dilució (de manera que es treu de pressa el crioprotector i es minimitzen els efectes tòxics que pugui ocasionar).